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miRNA 在發揮作用之前，需要同細胞內Germin3、Germin4和Argonaute蛋白家族成員eIF2C2因子等協同因子結合形成蛋白質-RNA復合物（miRNA-containing ribonucleic protein，miRNP），在miRNP的作用下指導其識別同源mRNA，研究認為miRNP即為RISC，并引起靶mRNA的降解或翻譯的抑制。
當RISC復合體與miRNA的向導鏈結合之后，便進行mRNA的識別。絕大部分RISC復合體與靶標mRNA之間的結合能（binding energy）都來自于miRNA種子區的核苷酸。即RISC復合體之所以能夠被靶標識別并結合主要是因為RISC具有固有的、非特異性的親和力。但是，靶標的可結合性是直接與其降解效率相關的，這說明RISC復合體并不能夠打開RNA分子的二級結構。
在細胞內，mRNA分子均與核蛋白（ribonucleoproteins，RNP）結合在一起，以復合體的形式存在，因此mRNA分子的可識別性還會受到幾種RNA結合蛋白的影響，因為這些蛋白有可能會遮蔽mRNA分子的結合位點或者打開mRNA的二級結構。因此，RISC復合體的作用似乎就是根據結合的靶標而定的。它的作用模式不僅會受到靶標mRNA分子上用來與miRNA結合的位點結構的影響，還會受到與每一個Argonaute蛋白結合的RNA結合蛋白的影響。比如，在動物體內，miRNA至少可以通過作用于靶mRNA 3’端非翻譯區里的結合位點的三條各不相同的途徑來沉默基因表達（切割mRNA靶標分子、抑制mRNA靶標分子的翻譯表達，或降解mRNA靶標分子）。
不過，對于每一個單獨的miRNA-mRNA沉默復合體來說，由抑制翻譯和直接降解而造成的基因沉默效果并不相同。此外，最終的沉默效果可能還會受到其他能夠與靶mRNA或RISC復合體發生相互作用、抵消miRNA的蛋白質的影響。這樣，每種組織因其所含蛋白的不同，導致了完全不同的調控結果。
圖1 miRNA介導基因沉默機制
圖2 miRNA接到信使RNA降解
miRNA對靶基因的調控表現在轉錄后水平上，通過對靶基因mRNA的切割或對其翻譯抑制兩種機制來下調靶基因的表達。這兩種機制的選擇主要取決于它與靶基因mRNA序列互補的程度，如果miRNA與靶基因mRNA完全互補，miRNA將通過切割方式來調控靶基因；如果miRNA與靶基因mRNA不完全互補，miRNA將通過翻譯抑制的方式來調控靶基因；并且對靶基因翻譯的抑制可能需要多種miRNA分子的協同作用。在動物體內，大部分miRNA不能與靶基因的mRNA完全互補，故被認為主要通過翻譯抑制的方式來調控靶基因。
在大多數情況下包括人類，大多數動物復合物中的成熟miRNA與靶基因mRNA 3’端非翻譯區（untranslated region，UTR）不完全互補配對，在轉錄后水平抑制靶基因的表達，抑制該基因的翻譯過程，從而抑制基因的表達。
miRNA 以4種不同的方式抑制蛋白質表達：（1）與翻譯偶聯的蛋白質降解；（2）翻譯延長的抑制；（3）翻譯提前終止（核糖體脫落）；（4）翻譯起始的抑制。另外，盡管有不完全的mRNA-miRNA堿基配對，動物miRNA能夠誘導mRNA靶基因大量降解。微RNA還可以在稱為mRNA 加工體或P體（不存在翻譯機制）的獨立細胞質位點，通過螯合mRNA 使其沉默。miRNA 是否進行mRNA降解主要取決于miRNA 結合位點和RNA 環境的特定性質，最可能的決定因素是miRNA與特定標靶結合蛋白的特殊相互作用。miRNA可以與Ago2結合，將與它們結合的靶基因 mRNA 轉移到并富集于細胞質的某一部位，在那里mRNA被破壞，這個部位被稱為P小體，P體的其他組分，如GW182、CAF-CCR4-NOT脫腺苷酶復合物、脫帽酶DCP2、脫帽激活因子（如 DCP-1、EDC3、Ge-1）和RNA解旋酶RCK/p54 等都參與miRNA功能。
另一方面，當miRNA與mRNA完全互補配對時，則引起目的基因mRNA在互補區的特異性斷裂，從而導致基因沉默，這種miRNA對靶基因mRNA的切割對靶基因mRNA的切割是大多數植物、病毒和部分動物的miRNA調控靶基因的主要方式。miRNA可以指導對靶基因mRNA的多次切割而本身保持完整，這種作用方式與siRNA類似，miRNA對基因的調控也是通過構成RISC來進行的，RISC是其調控的物質基礎。RISC組成的核心成分是miRNA或siRNA以及各種蛋白，其中Ago蛋白是該復合體中的核心蛋白，具有非常重要的作用。