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圖1 生物信息學在miRNA研究中的應用
當開始研究一基因是否為一個miRNA調控的靶基因時，可以用不同的生物信息學計算方法來分析每個序列（如mRNA的3'-UTR區序列），這些計算方法采用不同的參數來預測一個給定的靶mRNA內具功能性miRNA結合位點的可能性。由于每種 計算方法的有效性不同，下面3種計算方法應該被用來預測miRNA結合位點： miRanda、TargetScan和PicTar.這3種計算方法都允許研究者輸入一個基因符號，這些計算方法將計算此基因內所有預測的miRNA結合位點。此外，這些計算方法可測定一個給定的miRNA所有的靶mRNA.因為不同的計算方法會預測出不同的miRNA結合位點，所以同時使用多種計算方法進行預測非常必要。值得注意的是，盡管miRNA結合位點在不同物種間的保守性是各種不同計算方法的組成部分，但并不是一個功能性位點所必需的。由于不同計算方法預測的結果存在很大的差異，如何確定哪些預測的結合位點需要進一步的實驗驗證成為研究者要面臨的一個難題。作者認為至少這3種計算方法中的2種計算方法均預測到的miRNA結合位點，有必要進一步用實驗驗證。
因為很多經種子序列匹配預測的miRNA靶經體內驗證實驗證實并不是真的miRNA靶，為了起始一步減少預測到的抑制一給定的靶mRNA表達的miRNA的數量，進一步的程序分析是有必要的。結構特征控制著miRNA/mRNA間的相互作用的觀點已被越來越多的人所接受。例如，一個RNA分子的大部分結構是高度復雜性的，只有特定的單鏈區域允許miRNAs接近并與互補位點結合。因此，復雜的RNA二級結構可能阻止miRNA/mRNA的相互作用。最近有研究證實，絕大部分已證實的靶的一個共同特征是優先與基于熱動力學在RNA分子中容易接近且沒有復雜二級結構的3’-UTR區中的位點。由于RNA可接近性可能是靶識別的一個關鍵特征，所以有必要采用mFold軟件測定預測到的miRNA結合位點5’端和3’端各70個核苷酸的自由能，當其低于平均隨機自由能時提示此位點允許miRNA接近并結合[20].這些允許miRNA接近并結合起來的位點，有必要進一步用實驗進行驗證。
在不同物種中成熟miRNA均是從具有莖環狀二級結構的前體加工而來，具有較大的序列同源性?？寺〉降膍iRNA序列通過檢索基因組數據庫找到在基因組中的位置，在和周圍基因組序列比較中發現他們同樣具有相似的前體結構，多位于編碼基因間或內含子反向重復區域。一些miRNA基因在進化上具有高度保守性，此為生物信息學篩選的基礎。該方法根據比較基因組學原理，并結合生物信息軟件在已測序基因組中進行搜索比對，根據同源性的高低再進行RNA二級結構預測，將符合條件的候選miRNA與已經通過試驗鑒定的miRNA分子進行比較分析，最終確定該物種miRNA的分步及數量。目前國際上較為普遍使用的兩個計算機分析工具是miRseeker和miRscan，前者已用于果蠅及昆蟲基因組候選基因的系統分析，后者則用于線蟲和脊椎動物候選基因的分析。這兩個工具已經成功鑒定出了大量的miRNA基因并通過了實驗證實。由于miRseeker和miRscan的高靈敏度，它們已用于人類miRNA基因的尋找。由于該方法只能用于已完成基因組測序的物種，而那些未完成測序的物種就無能為力，而且由于miRNA前體長度的可變性，故用計算機方法尋找新基因具有一定的遺漏性，所以目前大多數實驗室將計算機分析與實驗方法結合使用，使得miRNA的發現量成幾何級數增長。目前日益發展的微陣列技術也在篩選miRNA基因方面顯示了極大的潛力。
隨著疾病特異性的miRNAs不斷被鑒定，對感興趣的疾病通路中的新靶基因進行驗證可能催生新的治療策略。因此，能夠鑒定和驗證miRNA/mRNA靶配對具有極其重要的意義。盡管生物信息學方法和自由能分析并不完美，但可使作者能夠對推測的miRNA/mRNA靶配對進行鑒定。一旦生物信息學方法預測成功，可以通過以下4條標準驗證miRNA/mRNA靶配對的真實性。（1）miRNA/mRNA靶相互作用得到驗證。（2）miRNA/mRNA共表達。（3）給定miRNA對其蛋白表達有可預測的影響。即用此miRNA的類似物可減少靶基因表達水平，而用此miRNA特異性抑制劑可增加靶基因的表達水平。（4）miRNA介導靶基因表達的調控導致相應的生物學功能的改變。