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    RNA pull- down實驗常見問題

    問題1RNA 降解

    可能原因:1)無核酸酶的環境被破壞

    2)體外轉錄的RNA探針降解

    解決辦法:1)清洗和使用新開的離心管和試劑等

    2RNA探針合成后,電泳檢測其長度和濃度

     

    問題2RNA結合蛋白的親和力不夠:

    可能原因:1)結合緩沖環境沒有優化

    2)裂解不完全

    3)磁珠用量不足

    4RNA探針用量不足

    解決辦法:1)優化孵育時間、溫度 、鹽濃度等條件

    2)增加裂解液和蛋白上樣量的比例

    3)增加裂解液

    4)增加磁珠用量

    5)增加探針用量

    6)確定生物素和鏈霉親和素效率

     

    問題3RNA結合蛋白沒有結合

    可能原因:1)靶蛋白量不足

    2)緩沖體系不對

    3RNA探針和蛋白的親和力本來就低

    解決辦法:1)增加上樣蛋白量

    2)應用低鹽體系

    3)加入交聯試劑

     

    問題4:結合的非特異性高

    可能原因:1)緩沖環境沒有優化

    2)緩沖環境嚴謹性低

    3)樣品沒有裂解完全和裂解體系沒有優化

    解決方法:1)優化孵育時間溫度 鹽濃度等條件

    2)使用嚴謹性高的緩沖體系

    3)調低RNA探針和樣品的比例

    4)提高裂解液的量

     

    問題5WB信噪比高

    可能原因:1)陽性信號率低

    2)一抗效率低

    3)蛋白沒有充分溶解

    解決方法:1)增加二抗的量

    2)用敏感度的化學發光液

    3)用細胞裂解液預孵一抗

    4)增加樣品的量

    5)確定有沒有其他可能的結合情況

    6)增加裂解液用量


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