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1：RIP試驗需要注意什么？
（1）防止RNA與蛋白非特異性結合。（2）避免RNA蛋白質結合被破壞。
（3）避免外源RNase污染。 （4）抑制內源RNase的活性。
（5）選擇適合做RIP的抗體。 （6）避免RNA結合蛋白的降解。
2：為什么抗體無法沉淀RIP裂解液中的目標蛋白？
（1）先進行IP或者WB，測試抗體可以與目標RBP結合。
（2）另選一個能與抗原其他表位結合的抗體。
（3）盡可能選用密理博RIPAb+抗體。
（4）稀釋抗體成濃度梯度，進行IP測試。
（5）4℃過夜孵育抗體與RIP裂解液。
（6）確定抗體類型與Protein A/Protein G匹配。
3：提取RNA時，蛋白酶K消化不完全是什么原因？
當進行蛋白酶K消化時，確保水浴溫度應設置在55℃左右，長期在65℃以上孵育會導致蛋白酶K失活。
4：提取RNA后，A260/A280比值偏離1.8~2.2區域是什么原因？
（1）需要縮短酚氯仿提取RNA的時間間隔。
（2）測試提純后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA發生了降解。
5：做RIP的時候和beads孵育的lysate的濃度如何確定？有些動物的文獻提到用細胞板數細胞個數，想知道如果用蛋白濃度的話，大概在什么數量范圍的蛋白總量對應50 ul BEADS?
50 ul beads對應的是一個reaction，而我們推薦一個reaction是100ul裂解上清（2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到），所以只需要在裂解前計數一下，并按括號中的比例加入裂解buffer，后續100 ul 裂解上清就是一個reaction的蛋白用量。不建議通過裂解后測蛋白濃度的方法進行配比。
6：RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質復合物嗎？
理論上，可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本，再進行RIP實驗。但需要特別注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。
7：因為RIP做完得到的是RNA序列，要做后續檢測，比如測序、判斷目標序列位置等，是不是都必須要做RT-PCR，得到逆轉錄的DNA后，后面就跟ChIP相同了？
常見的用real time qRT-PCR。如果對照的目的是保證兩個樣品間加入的細胞量一致或者進行定量，理論上說，使用input作為判別，計算不同樣品上樣量的差異。如果對照的目的是為了看IgG以及目的抗體富集的非特異性mRNA的量的話，那么可以找一個確定不會與目的抗體結合的RNA片段設計primer進行qPCR，用來看IgG以及目的抗體拉下來的背景情況。RIP可以看成是普遍使用的染色質免疫沉淀ChIP技術的類似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實驗的優化條件與ChIP實驗不太相同（如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經RIP實驗驗證等等）