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1 RIP實驗
RIP技術(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉淀),是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術。運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析;即用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質中內源性的RNA結合蛋白,防止非特異性的RNA的結合,免疫沉淀把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來,結合的RNA序列通過microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或 高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。是了解轉錄后調控網絡動態過程的有力工具,能幫助我們發現miRNA的調節靶點。
圖1 RIP實驗流程
2 RNA pull-down實驗
使用體外轉錄法標記生物素RNA探針,然后與胞漿蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白質復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合,從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后,通過western blot實驗檢測特定的RNA結合蛋白是否與RNA相互作用。
圖2 RNA pull-down實驗流程
3 Luciferase實驗
熒光素酶(Luciferase)是自然界中能夠產生生物發光的酶的統稱,不同的能夠控制發光的生物體用不同的熒光素酶來催化不同的發光反應。
螢光生成反應通常分為以下兩步:
螢光素+ ATP→ 螢光素化腺苷酸(luciferyl adenylate)+ PPi
螢光素化腺苷酸+ O2→ 氧螢光素+ AMP +光
熒光素酶的基因可以被合成并插入到生物體中或轉染到細胞中,將不同類型的細胞(骨髓干細胞、T細胞等)標記上(即表達)熒光素酶,就可以用高敏感度的CCD相機進行對動物體內進行活體觀察而不會傷害到動物本身。在熒光素酶中加入正確的螢光素底物就可以放出熒光,而發出的光子可以被光敏感元件,如螢光探測器或改進后的光學顯微鏡探測到。這就使得對包括感染在內的多種生命活動進程進行觀察成為可能。
圖3 Luciferase研究增強子原理
圖4 Luciferase常用載體
圖5 Luciferase片段缺失分析實驗流程
圖6 Luciferase定點突變分析實驗流程
熒光素酶分析可應用于啟動子研究中分析順式作用元件和反式作用因子、藥物篩選、siRNA和miRNA篩選、分泌途徑及蛋白定位報告基因檢測、活細胞的實時動態研究、信號轉導通路分析、難轉染的細胞(包括干細胞和原代細胞)的研究、RNA剪接研究。
雙熒光素酶報告基因測試,是結合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進的共報告基因測試技術。在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達時,通常采用第二個報告基因來減少實驗的變化因素。雙熒光素酶報告基因測試系統,結合pRL載體系統,表達第二個報告基因海洋腔腸熒光素酶,在單管中進行雙熒光素酶報告基因測試,快速、靈敏、簡便。其應用廣泛,可同時分析多個調控元件、同時分析多個信號轉導通路、單次篩選一個以上的靶點(包括脫靶效應、分析兩個或多個通路之間的相互作用)。