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    miRNA的一般研究策略

    日期:2019-03-26 標簽:miRNA的一般研究策略

    miRNA也稱微RNA、microRNA,是真核生物中廣泛存在的一種長度為21-23ntRNA分子,可通過與mRNA的結合,抑制mRNA的轉錄,因此在基因表達調控、細胞周期、生物體發育時序等方面起重要作用。miRNA的一般研究策略及相關實驗手段.png

    1 miRNA的一般研究策略及相關實驗手段

     

    生物信息學預測靶基因

    要對miRNA進行研究,首先需要采用生物信息學的方法預測miRNA的靶基因位點,即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITArna22 algorithms。

     

    靶基因的預測結果確認

    進行靶位點預測之后,接著是要通過miRNA pulldown方法,識別靶基因位點。其中,有以下三種常用的pull-down方法:

    (1)生物素化的miRNA pull-downbiotinylated miRNA pull-down)。通過生物素標記的合成miRNA轉染細胞,孵育后裂解細胞,用鏈霉親和素包被磁珠吸附篩選miRNA及其作用的mRNA。

    miRNA的一般研究策略及相關實驗手段.png

    1 miRNA的一般研究策略及相關實驗手段

     

    生物信息學預測靶基因

    要對miRNA進行研究,首先需要采用生物信息學的方法預測miRNA的靶基因位點,即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITArna22 algorithms。

     

    靶基因的預測結果確認

    進行靶位點預測之后,接著是要通過miRNA pulldown方法,識別靶基因位點。其中,有以下三種常用的pull-down方法:

    (1)生物素化的miRNA pull-downbiotinylated miRNA pull-down)。通過生物素標記的合成miRNA轉染細胞,孵育后裂解細胞,用鏈霉親和素包被磁珠吸附篩選miRNA及其作用的mRNA。

    生物素化的miRNA pull-down.png

    圖2 生物素化的miRNA pull-down

    (2)標記的miRNA pull-downlabeled microRNA pull-down assay,LAMP),通過用地高辛(DIG)標記的pre-miRNA寡核苷酸與細胞提取物混合孵育,用抗地高辛的抗體做免疫共沉淀(IP),獲得被共沉淀的mRNA。

    (3)核蛋白免疫共沉淀-RNA高通量測序Ribonucleoprotein immunoprecipitation followed by microarray chip analysis,RIP-Chip,RIP-seq),通過用合成的miRNA轉染細胞,孵育后裂解細胞,用特異的抗AGO2抗體對RISC進行免疫共沉淀,對獲得的mRNA進行microarray分析。

     

    RIP-Chip基本實驗流程.png


    3 RIP-Chip基本實驗流程

      

    3 miRNA的直接功能確認

    通過實驗方法驗證miRNA是否能特異結合靶mRNA并特異抑制其表達。

    (1)3’-UTR reporter assay

    通過在報告基因如熒光素酶CDS的下游3’-UTR區域插入待確認的目的基因,克隆到載體如psiCHECK-2上,載體轉染細胞,再用miRNA進行處理,如果目的基因上含有靶位點,則熒光素酶的轉錄受到抑制不發熒光。

     

    3’-UTR報告基因基本實驗流程.png


    4  3’-UTR報告基因基本實驗流程


    3’-UTR報告基因驗證miRNA直接作用情況.png

    5  3’-UTR報告基因驗證miRNA直接作用情況


    (2)miRNA的上調與下調

    通過人工合成miRNA模擬物(miRNA mimics)或miRNA抑制物(miRNA inhibitor),增強或抑制miRNA的抑制效果,并與對照相比。

     miRNA的上調與下調驗證miRNA直接作用情況.png


    6 miRNA的上調與下調驗證miRNA直接作用情況

     

    (3)位點定向突變(site-directed mutagenesis

    首先,將待測基因反轉錄為cDNA,通過用致突變的引物對cDNA模板進行重疊PCR擴增;然后,用相關的酶(一般為Kinase-Ligase-DpnI)對cDNA模板進行消化,克隆到報告基因載體;最后,將構建好的克隆轉染至細胞,檢測報告基因的表達。若表達顯著下降,可表明靶位點定位準確。

    位點定向突變基本實驗流程.png

    位點定向突變基本實驗流程

     

    4 miRNA的整體功能驗證

    miRNA的上調/下調,通過Western Blot或其他生物學通路分析實驗,探究miRNA最終是如何影響細胞、疾病等等情況。

     

    5 miRNA的定量和定位

    通過RT-qPCR、原位雜交(in situ hybridization)、microarray等實驗手段,確定miRNA的具體表達量及其所在位置,以明確補充其機理研究。



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