走向基因組3D世界 ——染色體構想捕獲技術3C(chromosome conformation capture)

日期：2018-11-30 標簽：染色體構象捕獲,3C,4C,5C,HiC

在過去10年中，染色體構象捕獲（chromosome conformation capture 3C）技術及其該技術的拓展技術(4C,5C,Hi-C, ChIA-PET)，使人們能夠以超強的分辨率和高通量測序分析細胞核內的三維立體結構

一、3C技術：走向三維（3D）基因組學的基礎

1.交聯：用甲醛交聯染色質，固定蛋白與DNA，使染色質保持三維結構。

2酶切：再用一種限制性內切酶（HindIII、BglII、SacI、BamH或EcoRI）切割染色質，蛋白周圍的互作基因切開。使互作DNA與其他非互作DNA分離。

3連接：重新連接交聯DNA片段的粘性末端?；プ鱀NA的兩端具有相同的粘性末端，可以互相連接形成loop。

4 PCR：第3步形成的loop有兩種，一種是同一基因間的loop，一種是互作基因間的loop，用PCR的方式區分這兩種loop。

Fig.1染色體構象捕獲（3C）過程

二、3C的延伸：4C,5C,Hi-C, ChIA-PET 

3C技術主要是研究點對點的基因互作，即特定的兩個基因間的互作，如基因A與基因B的互作。如果我們想研究一個基因與多個基因互作，或多個基因與多個基因互作呢？這就衍生出了4C,5C,Hi-C技術。如果我們想知道特定蛋白下的基因互作呢？這就衍生出了ChIP-loop和ChIA-PET。

Fig.2 3D基因組研究方法綜述

◆3C (one-vs-one)

主要研究點對點的基因互作

◆4C (one-vs-all)

主要研究一個特定基因與其所有互作的基因的互作。4C是在3C基礎設計了雙酶切位點，然后通過成環的形式，保證了只需要設計1對引物，就可以檢測1個位點對多個位點的相互作用。 最后一個C為circle，環化，這也是4C中最關鍵的一步。

◆5C (many-vs-many)

主要多基因與多基因的互作。5C技術是在4C的技術上，加了個tag標簽，導致可以檢測many-to-many的相互作用。

◆Hi-C (all-vs-all)

Hi-C使用了高通量測序的方法，理論上它能夠捕捉到所有的基因間的互作。HiC基本步驟是，甲醛交聯，限制酶切，末端補平加biotin，平末端連接，超聲破碎，biotin富集，建庫測序。整個過程是沒有特異性引物存在的。而且依靠高通量的測序技術，Hi-C可以展現出，整個染色體all-to-all的互作關系。

◆ChIP-loop （one-vsone）

ChIP-loop是使用特異性抗體捕獲蛋白，檢測與這個蛋白特異結合的兩條DNA，連接兩條互作DNA，形成loop，再進行PCR檢測。（ChIP+3C）

◆ChIA-PET (all-vs-all)

ChIA-PET 是用抗體將目標蛋白捕獲下來，然后加入adapter后，再進一步用Hi-C方法得到通過目標蛋白進行相互作用的所有基因（ChIP+adapter+Hi-C）

三、應用案例

應用一：3C

3C技術已經在β-珠蛋白中得到證實：

 Fig.3

3C數據和ACH active chromatin hub活性染色質中樞。（A）3C數據展現小鼠β-珠蛋白基因附近的增強子loop。此圖展現的是β-major基因與其他染色質的互作位點，β-major基因為3C的錨定點，灰色區域為檢測的互作區域，紅色箭頭所指為強結合位點，即形成loop的區域，紅色折現表示胎鼠肝臟組織中的基因間的互作強度，藍色折現表示胎鼠大腦中的基因間的互作強度，胎鼠肝臟中β-珠蛋白基因為激活狀態，形成loop，胎鼠大腦中β-珠蛋白基因為沉默狀態，未形成loop，（b）基于b-globin locus位點的各種3C實驗，提出了ACH模型。示意圖顯示了β-珠蛋白基因活化時的染色質構想。

應用二：4C 

Fig.4 

(A)在4C-seq中，在成環處設計測序特異引物PCR，可以使得產物可以在不用建庫的情況下測序。讀數包含引物和連接節點。在去除引物序列后，其余的讀數與基因組比對。（B）染色體圖顯示小鼠RAD23位點在神經前體細胞中的原始4C-seq統計。4C剖面顯示了側向的特征峰。(C)利用窗口化方法，例如運行平均值或中值，對數據應用低通濾波器，從而可以基本上無噪聲地觀察染色體相互作用。(D)最后，可以采用高級分析，例如用于可視化的域圖或基于錯誤發現率(FDR)的方法來識別統計上顯著的相互作用。域圖是在給定區域中富集4C捕獲的多尺度表示。高亮區域顯示顯著富集4C捕獲的基因組區域?；贔DR的方法可用于識別顯著富集的區域。紅色的弧線顯示與哪些基因形成了連接節點。

應用三：5C與Hi-C

Fig.5 

5C和HiC提供相互作用頻率的矩陣。(A)對非活性和活性a-globin locus (頂部)周圍500kb的5C結果進行建模，以表明活性位點采用更開放的構象，而在非活性狀態下，該位點顯示封閉構象(底部)。（b）基于HiC數據，可以繪制染色體寬的相互作用頻率矩陣。示出具有1-MB分辨率（具有100 kb的步長）的人類染色體14的接觸圖。中間面板顯示格子狀圖案，這是HIC分析方法的最終結果。右邊的面板顯示了一個分形球體，一個基于HiC數據和理論分析的人類染色體組織模型。

應用四：ChIA-PET

ChIA-PET最近被應用于揭示CTCF介導的相互作用體在小鼠胚胎干細胞（ESC）中的作用。由CTCF形成的識別環能夠將增強子與啟動子分開，以及活性染色質與非活性染色質分開，因此對于其絕緣子功能或促進遠端增強子與基因之間的通信非常重要（fig 6）。

Fig.6 

CHI-PET為CTCF蛋白的染色體互作提供了深入的了解。（a）三個ChIA-PET文庫，用于分析絕緣體蛋白CTCF與染色體結合的結果。配對末端標記顯示兩個結合位點之間可能的相互作用。在基因組位點之間形成弧形突出環。（b）在A中顯示的軌跡折疊的可能模型的示意性表示。

四、結語

　　我們生命體中的染色體不是線性的、一維的，而我們現在大部分轉錄調控水平的實驗方案設計，都是基于一維線性模型上設計的，這樣很有可能出現一些結果偏差，因此現在很多數據庫，也開始考慮加入基因遠程調控的影響。

　　為了真正了解基因組調控機制，需要基于3C技術，將我們基因組中的線性DNA信息轉換為有功能性3D-基因組網絡。3D基因組的研究在個體發育、在表觀遺傳、在腫瘤行成轉移、在衰老，這些領域中有著重要的研究意義。也許你的基因看上去沒變化，但是你就不一樣。

參考文獻：Tolhuis B, Palstra RJ, Splinter E, Grosveld F and de Laat W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. Mol. Cell. 2002,?10?(6): 1453–1465.?PMID?12504019.?doi:10.1016/S1097-2765(02)00781-5.