3D基因組學：一個嶄新的領域

日期：2018-11-15 標簽：3D基因組,TAD

倘若僅是回望基因組學本身的發展歷程——從1977年首個生物基因組噬菌體φX174序列被測定，到2003年人類基因組計劃完成，再到2012年ENCODE計劃完成——還不足以代表人類解讀生命遺傳奧秘的歷史。我們更應該回顧和基因組學不分家的遺傳學之發展歷程。

高中的生物學課堂就已經學到，Gregor Johann Mendel（孟德爾）是遺傳學的奠基人，他的“豌豆雜交實驗”（1856-1863年），依然是中學生物考題的常用材料。隨后，對孟德爾由路轉粉的Thomas Hunt Morgan（摩爾根）利用果蠅的突變體，首次確認基因位于染色體上，提出“連鎖互換定律”，成為了現代遺傳學的奠基人（1908-1915；摩爾根的貢獻非常多，這個時間段只是一個粗略的標記）。

對如今的我們來說，不難理解DNA與RNA是攜帶遺傳信息的物質。不過在上世紀中期以前，世人還認為蛋白質才是遺傳物質。1928年，Frederick Griffith（格里菲斯）的“肺炎雙球菌轉化實驗”，提出了轉化因子學說。但直到1944年，Oswald Avery、Colin MacLeod和Maclyn McCarty三人通過比較蛋白質、多糖與DNA等的轉化效應，才逐漸樹立了DNA是遺傳物質的地位。到了1952年，Alfred Hershey與Martha Chase利用同位素分別標記蛋白質和DNA，最終確認了DNA是遺傳物質。

早在DNA發現之初（1869年，Friedrich Miescher），科學家便展開了對其物理結構的鑒定。但一直到1953年，才由James Watson和Francis Crick闡明了DNA的雙螺旋結構。

真核生物的基因組含有大量的結合蛋白，包括組蛋白。在原核生物中，也有組蛋白樣的DNA結合蛋白。1974-1976年間，科學家首次獲得DNA纏繞在組蛋白上的電鏡照片（Science. 1974 Jan 25;183(4122):330-2.，Exp Cell Res. 1976 Jan;97:101-10.），并最終在1997年獲得結晶結構（Nature. 1997 Sep 18;389(6648):251-60.）。

DNA-組蛋白這種beads on a string“串珠式”的結構，能夠顯著縮短DNA鏈在一維水平的尺度，大概7倍。形象一些，對于人類全部DNA而言，將DNA鏈線性展開，能得到約為2米的長鏈，再經串珠式壓縮，也還有約29厘米。顯然，這對于袖珍的細胞核來說，這種結構依然太大了。對染色體的形態觀察也提示，DNA與結合蛋白一定形成了更加高級的結構。

2005年，Timothy J. Richmond團隊首次報道了chromatin fiber（染色質纖維）的結構。2014年，中國科學家Ping Zhu和Guohong Li小組得到了更加精確的染色質纖維結構。他們的研究都證明，DNA-組蛋白的串珠式結構，還會進一步被壓縮成直徑僅有30納米的纖維結構。而在目前的理論模型中，這些染色質纖維還會在包括Cohesin、CTCF等蛋白的幫助之下，扭曲成環，形成更加復雜的結構，最終被壓縮成染色體。

講了半天歷史，目的是為了讓各位讀者能夠得到這樣一個基本認識：生命體的遺傳功能元件，包括編碼基因、非編碼基因、順式調控元件等，在空間結構上，并不是在染色體上呈線性地一字依次排開，而是隨著DNA形成復雜高級結構的同時，具備了三維組織形式。

為了加深印象，我們不妨再來看下方另外一幅染色體結構的卡通。簡而言之，DNA雙鏈就跟糾纏在一起的電話線一般，一圈圈地繞行、壓縮，最終形成了染色體。也正因為有這種繞圈圈的壓縮方式，我們不難想象，DNA能夠密密麻麻地形成許多環狀結構。這些環狀結構還能再繼續繞圈壓縮下去。

換句話說，在DNA一維層面上相隔比較遠的區域，反而有可能靠得更近。比方說下圖中的ABCD四個點，若以A為參照物，C比B遠，但由于基因組形成了高級結構，反而把A和C拉得更近。這個示意圖還提示了另外一個問題，即同一條染色體上的某些區域，可能很難互相接觸，比如B和D之間就，被環狀結構給隔開了。

DNA這種相對穩定的高級結構，是由蛋白質來維持的。這同時也為破解基因組的三維結構奠定了技術基礎。我們再來利用上面那個ABCD四個小點的圖來理解這一項技術。假如說，A和C是幫助DNA凹造型的蛋白，并且它們靠得很近，甚至有蛋白-蛋白相互作用。這時，我們使用甲醛等交聯劑，就可以把DNA-結合蛋白以及他們之間形成的高級結構給固定下來。但這種復合物體積非常龐大，為了方便測序建文庫，我們需要將DNA利用超聲或限制性內切酶打碎。這時候我們得到的，就是許許多多由蛋白質緊緊鎖住的包含缺口的小結構。我們再用酶把這些斷裂的DNA給修復回去，就會得到許多能夠發生相互作用的、具備環狀結構DNA了。最后，我們再通過測序的方法就能發現，原本中間隔了個B的A和C位點，居然靠到一起，而C和D雖然很靠近，但卻可能測不到它們在一起。

上面所述的方法，便是染色質構象捕獲（Chromatin Conformation Capture）技術。大致的流程，可以看下面的圖片。最早的技術路線（簡稱3C，源自英文名首字母），只能研究一個位點對另外一個位點的相互作用（一對一）。而后又發展出了4C（一對全），5C（多對多），Hi-C（全對全），Capture-C（多重一對一）等技術。只是隨著復雜度的提高，分辨率也會降低。相關綜述可以看這篇文章Unraveling the 3D genome: genomics tools for multi-scale exploration，這里就不詳述了。

通過構象捕獲技術，從全基因組的角度而言，科學家都得到了什么樣的發現呢？

許多小組都發現了一個共同現象：如下圖所示，基因組的相互作用，因其三維的物理結構，形成了許多分區。為了讀懂這個圖，我們需要先理解它是如何繪制。假設線性的染色體座位的藍、橙、綠三點之間能夠發生相互作用，我們就用線段把它們連起來，形成一個等腰三角形，并在線段的交叉點，用顏色的深淺，來代表相互作用的頻率，或者說強度。

通過這種方法作圖，可以得到許多三角形結構，密集排布在染色體之上。有些小的三角形，顏色比較深，代表著這個三角形內部的相互作用更頻繁，同時它們之間甚至有些“涇渭分明”地相鄰排布，即甚少與相鄰區域發生相互作用，從而形成不同的結構域?？茖W家將這樣的結構域稱為Topologically Associating Domain（TAD，中文名姑且翻譯為“拓撲相關結構域”）。但又不是說，小結構域之間就絕對不會發生相互作用了，只是頻率會比較低。數個相鄰且又能發生相互作用的TAD，就形成了Superdomain（超結構域）。隨著在染色體上的物理距離增大，相互作用的頻率會呈負指數式降低。

TAD里面會是些什么東西呢？

在哺乳動物基因組中，TAD通常由CTCF這個轉錄抑制因子給分割開來。CTCF還會和Cohesin蛋白復合物結合，幫助基因組形成相對穩定的三維結構。正由于此，兩個TAD之間的轉錄活性是非常低的（轉錄需要打開DNA），而結合CTCF等轉錄抑制因子的DNA元件，也被稱為insulator（絕緣子）。

不過，在TAD內部可就熱鬧了。CTCF在幫助基因組DNA凹造型的同時，就把線性展開時距離較遠的DNA元件給綁到了一起。而這樣相互作用的元件，通常是enhancer（增強子）和promoter（啟動子）。

這樣做有兩個好處。一是縮短了enhancer和promoter之間的空間距離，增強了基因的轉錄。二是給調控元件合理分區，使得基因轉錄在不同發育階段、不同生理條件下，受到特定enhancer的調控。比方說，在胚胎發育早期，干細胞那套基因的表達會占主導。隨著發育的進行，表達模式會逐漸替換成特定lineage的基因，再到成熟細胞的基因。倘若沒有這樣的動態調整的三維分區，這種基因的空間與時序性表達機制，估計就很難實現了。

當然，這里并不是在表達一種設計論的觀點。這種精致的調控機制，是在漫長的進化過程中，逐漸選擇、適應的結果。

TAD除了形成相對穩定的遺傳信息表達功能結構之外，還有其他重要的生物學意義。比如它同樣也是細胞周期S期時，DNA復制的結構單元。在不久的將來，科學家還將發現更多的三維基因組功能。

讀到這里，我想各位讀者應該不難理解，假設基因組的三維結構出了差錯，后果可是相當嚴重。這里本司機舉兩個例子來說明。

首先，維系正常的基因組三維結構，對保持正常的發育進程有重要的意義。早有文獻通過經典的遺傳學方法，將F syndrome（表現為手指、腳趾、腭和胸骨發育異常）這種遺傳疾病定位到了染色體2q36處。這個區域含有對發育具有重要意義的IHH、WNT6A、WNT10A、PAX3和STK36等基因。如下圖所示，最近的研究證明，在有些F syndrome的病例中，WNT6A基因所在的TAD邊界染色體區域發生了翻轉，使得相鄰TAD的增強子跑到WNT6A所在的TAD之中，導致WNT6A異常表達。在小鼠模型中，用CRISPR敲除PAX3基因所在TAD的邊界，同樣會導致相鄰TAD的增強子跑過來調控PAX3，使其表達量異常升高，造成小鼠指骨發育異常。與此對照，用CRISPR敲除相鄰TAD內部的序列，不碰及PAX3所在TAD的邊緣，PAX3基因的表達水平就不會異常升高，也不會有發育異?，F象

第二個例子來自于癌癥。腫瘤細胞的基因組是非?；靵y的，有許多擴增、缺失和易位。拿原癌基因為例，它的高表達可以來自于原癌基因本身的拷貝數增加，也可以是其表達調控機制得到了增強。這篇綜述（Copy number alterations unmasked as enhancer hijackers.）為我們詳解，非編碼區域拷貝數的異常，是如何導致原癌基因的過度表達的。比如說，MYC基因座位的易位，導致它跑到一個IGH增強子附近（a）。MYB基因附近的染色體區域缺失，把遠處的QKI增強子給帶到它身邊（b）。TAL1所在TAD邊緣的染色體區域缺失，導致相鄰增強子越俎代庖（e）。IGF2基因座位跨TAD的倍增，導致原本不能調控IGF2的、來自隔壁TAD的增強子，推動了IGF2的表達（f）。其他的機制，就請讀者自行讀圖。而這種現象，科學家將其命名為enhancer hijacking（增強子綁架）。