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安利——lncRNA的亞細胞定位數據庫
日期：2018-01-02 標簽：安利——lncRNA的亞細胞定位數據庫
圖片來源：網絡
長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是一類本身不編碼蛋白,長度在200-100000nt之間的RNA分子的長鏈非編碼RNA分子。 lncRNA的作用機制非常復雜，例如細胞核中的LncRNA可以通過直接與靶基因結合來激活或抑制靶基因的表達，還能通過參與組蛋白修飾或募集轉錄因子而參與基因的表達調控；而細胞質中的LncRNA也可以作為一種競爭性內源性RNA與miRNA相互作用，參與靶基因的表達調控。那么，我們在選定了一個lncRNA的時候如何確定它是在細胞核還是細胞質中起作用？
在確定一個lncRNA在細胞中的定位我們可以通過RNA的免疫熒光原位雜交也就是RNAFISH在細胞水平上對LncRNA進行定位。
進行FISH之前我們也可以通過數據庫去預測我們的lncRNA在一些細胞系中的定位，給我們的實驗做一個參考。在此介紹一個亞細胞定位的數據庫：
lncATLAS（http://lncatlas.crg.eu/）
該數據庫是以15個細胞系的高通量測序數據為基礎，收錄了來源于GENCODE注釋的6768個lncRNA數據。
首先打開數據庫：
輸入框中輸入lncRNA的名稱或者ID號，或者直接選擇給出的lncRNA，再點擊GO就可以獲得數據庫中收錄的lncRNA的亞細胞定位。
以MALAT1為例來展示lncRNA的定位查詢：
在框中輸入lncRNA名稱MALAT1
可以看到MALAT1在大部分細胞中定位于細胞核中
另外，還可以同時在下方選擇增加一些RNA作為參考
可以看到MALAT1和TUG1在給出的細胞系中幾乎都是位于細胞核，而H19則在大部分細胞中位于細胞質中，在少數細胞中位于細胞核中。
在對MALAT1在細胞中的定位有了一個初步的判斷之后，則需要用RNA的免疫熒光原位雜交驗證lncRNA在細胞中的定位。
簡單介紹RNA FISH：
免疫熒光原位雜交是將已標記的核酸探針與組織切片或細胞中的待測核酸中的互補序列雜交,從而對組織細胞中的核酸進行定性、定位和相對定量分析。
RNA FISH的第一步就是進行探針的制備，RNA探針制備首先是一段與目標RNA互補的序列，RNA探針通常需要選擇與目標RNA上的特異序列互補的片段以提高定位的準確性。
探針的標記方法可以分為直標法和間標法：直標法就是在RNA探針上直接標記熒光基團；間標法是在RNA探針上標記是生物素或者地高辛等，在標記的探針與細胞中靶標RNA結合后再通過與帶熒光標記的二抗結合來達到使RNA復合體帶上熒光信號的方法。
下圖即為用生物素標記的探針進行免疫熒光原位雜交的過程：
圖1 RNA FISH實驗流程
（1） 探針制備：通過體外轉錄過程時RNA探針標記上生物素或者用末端標記法標記生物素，探針純化回收備用。
（2） 細胞爬片或組織切片樣本的準備：細胞爬片或組織切片樣本經過固定-增加細胞膜透性-脫水等處理。
（3） 探針與細胞靶標RNA雜交：探針通過堿基互補與細胞內的靶標RNA結合。
（4） 耦合熒光鏈霉親和素：雜交的RNA-生物素用帶熒光標記的鏈霉親和素孵育與生物素結合使靶標RNA帶上熒光。
（5） DAPI復染：使用DAPI使細胞核內的DNA帶熒光以區分細胞核和細胞質部分。
（6） 熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察熒光信號位置和拍照保存。
細胞lncRNA的定位如下圖所示的lncRNA BCAR4位于細胞核中，以β-actin mRNA作為陽性內參，以無序的SCR序列為陰性內參。
圖2 lncRNA BCAR4 的細胞定位
免疫熒光原位雜交方法除了可以對單個RNA進行細胞內定位，還可以通過LncRNA與miRNA的雙RNA共定位研究LncRNA與microRNA的互作，以及RNA-蛋白的共定位研究LncRNA與蛋白的互作。
圖3-1 lncRNA與miRNA的雙RNA共定位
圖3-2 lncRNA OLA1P2與蛋白p-STAT3的細胞共定位
