RNA的m6A修飾在基因表達調控中的功能

日期：2017-12-19 標簽：RNA的m6A修飾在基因表達調控中的功能（m6A專題）

圖1  m6A調控mRNA代謝的模式圖

m6A作為mRNA的普遍的修飾，在含有METTL3的甲基轉移酶時mRNA前體轉錄后立即發生m6A甲基化;而FTO和ALKBH5負責m6A去甲基化。 通過甲基轉移酶和去甲基化酶之間的相互作用，m6A水平保持平衡，形成m6A結合蛋白的對接位點和RNA二級結構的適當組裝。具有足夠的m6A水平的mRNA轉錄物可被適當剪接，轉運，翻譯或降解。而不平衡的m6A調節將在上述每一步引起RNA代謝的缺陷。

1、影響mRNA前體的剪接

mRNA前體的剪接是基因表達中的重要步驟，它涉及內含子的精確切除和核中初級轉錄本外顯子的連接以產生成熟的mRNA。最早提出的m6A的作用之一是作為RNA剪接的調節劑，目前已有許多證據支持m6A與RNA剪接的相關性，盡管確切的機制尚不清楚。

例如，在經環亮氨酸處理的禽肉瘤病毒感染的細胞中，存在mRNA前體的顯著累積，而成熟mRNA的減少；從METTL3敲低的HepG2細胞的m6A-IP/RNA-seq數據分析顯示，許多基因特別是甲基化基因顯示異構體水平的差異表達，但是基因水平并無差異。同時，剪接的外顯子和內含子顯著富集了m6A峰，表明m6A與mRNA的選擇性剪接之間的內在聯系。

M6A對RNA剪接的作用可能是由于甲基化的發生會干擾剪接因子和mRNA之間的相互作用，m6A簇可能作為某些RNA結合蛋白的對接位點；或者，由于m6A使A-U堿基配的穩定性降低，RNA二級結構可能受到影響。另一個可能的機制是通過甲基轉移酶或脫甲基酶的相互作用，最近對ALKBH5的研究提出了m6A水平可能影響剪接因子的基因表達的另一種可能性。

圖2 m6A修飾對mRNA前體剪接的影響

2、調控RNA的核輸出

RNA剪接后，成熟的mRNA必須從細胞核中輸出以在細胞質中翻譯或降解。研究者檢測到STH處理的HeLa細胞中細胞核mRNA的保留時間增加了40％，但是多聚腺苷酸化的RNA沒有變化。在具有增強的m6A水平的ALKBH5缺陷型細胞中，通過5-溴尿苷（BrU）摻入分析觀察到新生合成的RNA主要分布在細胞質中。

據報道，不同的RNA種類通過核孔復合物利用不同的途徑進行核輸出。TAP-P15復合體是在銜接蛋白如ALY/REF銜接子、SR蛋白和TREX復合物的協助下用于mRNA輸出。由于ASF/SF2的磷酸化水平決定其在剪接或核輸出中的功能，因此推測由ALKBH5缺陷引起的ASF/SF2磷酸化減少將加強其與TAP/P15復合物的相互作用從而導致核mRNA輸出加速。與mRNA不同，rRNA可以招募幾種不同的途徑使其出口更有效率。rRNA核出口可能不會受到ALKBH5缺陷的顯著影響。有趣的是，ALKBH5缺陷也導致細胞質中SRPK1蛋白異常聚集。 SRPK1負責剪接因子的磷酸化，以促進其參與前mRNA的剪接。

3、調控mRNA翻譯

大多數m6A修飾發生在外顯子，m6A在剪接后仍保留在成熟的mRNA中，因此，m6A也可以影響含m6A的mRNA的翻譯。小鼠DHFR mRNA體外甲基化后用兔網織紅細胞系進行體外翻譯，當比較甲基化轉錄物的翻譯水平和非甲基化轉錄物的翻譯水平時，檢測到甲基化的Mrna的翻譯1.5倍增加。當從環亮氨酸處理的細胞中純化的細胞質轉錄物在體外翻譯時，由甲基化mRNA產生的DHFR蛋白的量比未處理的mRNA低20％。

近期的使用體外翻譯以及將報告基因mRNA轉染入細胞的研究顯示，與未甲基化的轉錄物相比，腺苷甲基化導致翻譯減少。因此，m6A對蛋白質生產的影響似乎在不同的mRNA中是不一致的。一種可能性是這種效應部分由轉錄本內的其它順式作用因子決定，或者mRNA中m6A的位置可能影響其與特定的介導其對翻譯的作用的反式作用因子相互作用的能力。

圖3  m6A修飾對mRNA翻譯的影響

4、影響mRNA的穩定性

 mRNA降解的調節是影響總體細胞mRNA豐度的主要因素。由于在poly（A）尾部中未檢測到m6A，因此它可能不涉及聚腺苷酸化依賴性的mRNA降解。 Camper SA等人已經通過用STH處理HeLa細胞來檢查對mRNA穩定性的影響發現，盡管在高達500μMSTH的存在下m6A抑制幾乎完全，但mRNA穩定性沒有受到很大的影響。然而，如通過高通量測序分析所鑒定的，m6A富集在3’UTR區域中,3’UTR包含mRNA降解所需的幾個重要功能域，如富含AU的元件（ARE），鐵反應元件（IRE）和細胞質聚腺苷酸化元件（CPE）。同時，3’UTR是microRNA（miRNA）靶向的區域，因此不能排除m6A參與調控mRNA穩定性的可能性。

舉例來說，潛在的m6A結合蛋白ELAV1 / HuR能夠結合ARE區并穩定相應的轉錄物。對照和METTL3敲低細胞中差異mRNA表達水平的分析表明m6A穩定mRNA。甲基化的失去降低含有m6A4的轉錄本的表達水平。這種效應對于在內含子中含有m6A的mRNA是最突出的。這些數據的一個可能的解釋是m6A是正確剪接mRNA所需要的，當被破壞時導致剪接受損和隨后的mRNA降解。m6A對mRNA穩定性的影響可能是基因特異性的，因此全局RNA穩定性的顯著變化不太可能發生。

圖4  m6A對mRNA穩定性的影響

5、與microRNA的關聯性

MeRIP-Seq數據集的分析揭示了m6A與miRNA結合位點之間的存在著很強的相關性。含有m6A峰的67％的3'UTR也含有至少一個TargetScan預測的miRNA結合位點。因為大約30％的基因在其3'UTR中具有miRNA結合位點，所以這是顯著增強的關聯。重要的是，m6A峰和microRNA位點不重疊。通常，m6A峰在終止密碼子附近是最豐富的，并且通常沿3'UTR長度頻率降低，而microRNA靶位點在3'UTR的5'和3'末端富集.m6A在3'UTR和miRNA結合位點的存在提示了mRNA甲基化和microRNA之間的相互作用。確定腺苷甲基化是否有助于microRNA誘導的mRNA沉默的作用將是重要的。

另外，目前已有相關證據證明了m6A影響microRNA前體的剪接加工：m6A在轉錄本上的存在會影響選擇性剪接，但是這種標記的核閱讀器能夠介導核轉錄本的處理，但還沒有被確定。研究人員發現RNA結合蛋白HNRNPA2B1在體內和體外結合帶有m6A的RNA， HNRNPA2B1直接結合一組核轉錄物并以與m6A“作者”METTL3類似的方式調節其選擇性剪接。此外，HNRNPA2B1與初級miRNA轉錄本子集中的m6A標記結合，與microRNA微處理器復合蛋白DGCR8相互作用，并促進pri-miRNA加工。

圖5  m6A對pri-microRNA剪接的影響

參考文獻：

1、Xu Zhao,Ying Yang,Bao-FaSun,et al.FTO-dependent demethylation of N6-methyladenosine regulates mRNAsplicing and is required for adipogenesis.Cell Research,2014,24:1403-1419

2、Kate D. Meyer,Samie R.Jaffrey. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expressioncontrol.Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(5):313–326

3、Hao Du,Ya Zhao,Jinqiu He,etal. YTHDF2 destabilizes m6A-containing RNA through

directrecruitment of the CCR4–NOT deadenylase complex.NAT COM,2016,7:12626

4、Yamei Niu,Xu Zhao,Yong-ShengWu,et al.N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: An Old Modification with A NovelEpigenetic Function.Genomics Proteomics Bioinformatics, 2013,8–17

5、Xiao Wang,Zhike Lu,AdrianGomez,et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNAstability.LETTER,2014,10.1038/nature12730

6、Claudio R. Alarcón,HyeseungLee,Hani Goodarzi,et al. N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing.Nature,2015,519(7544):482–485

7、Claudio R. Alarcón,Hani Goodarzi,HyeseungLee,et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m6A-dependent nuclear RNA processingevents. Cell,2015,162(6):1299–1